Analiza proteomiczna fagolizosomu Trichomonas vaginalis, celowanie lizosomalne i niekonwencjonalne wydzielanie peptydaz cysteinowych

Lizosom stanowi centralny przedział degradacyjny komórek eukariotycznych, jednak niewiele wiadomo na temat biogenezy i funkcji tych organelli u pasożytniczych protistów. Podczas gdy układ zależny od mannozy-6-fosforanu (M6P) dominuje w celowaniu lizosomalnym u metazoanów, u innych eukariontów donoszono o sortowaniu niezależnym od oligosacharydów. W tym badaniu zbadaliśmy proteom fagolizosomalny ludzkiego pasożyta Trichomonas vaginalis, jego ukierunkowanie na białka i udział lizosomów w wydzielaniu hydrolazy. Organelle oczyszczono za pomocą wirowania gradientowego Percoll i  OptiPrep  oraz nowego protokołu oczyszczania opartego na fagocytozie nanocząstek magnetycznych pokrytych laktoferyną.

Analiza dała proteom lizosomalny składający się z 462 białek, które podzielono na 21 klas. Hydrolazy reprezentowały największą klasę funkcjonalną i obejmowały proteazy, lipazy, fosfatazy i glikozydazy. Identyfikacja dużego zestawu białek zaangażowanych w ruch pęcherzykowy (80) i obrót rearanżacji cytoszkieletu aktynowego (29) wskazuje na dynamiczny przedział fagolizosomalny. Wykazano wcześniej, że kilka proteaz cysteinowych, takich jak TvCP2, jest wydzielanych. Nasze eksperymenty wykazały, że wydzielanie TvCP2 było silnie hamowane przez chlorochinę, która zwiększa wewnątrzlizosomalne pH, wskazując tym samym, że wydzielanie TvCP2 zachodzi raczej przez lizosomy niż przez klasyczny szlak sekrecyjny.

Nieoczekiwanie zidentyfikowaliśmy rozbieżne homologi receptora M6P TvMPR w proteomie fagolizosomalnym, chociaż T. vaginalis nie ma enzymów do tworzenia M6P.

  • Aby sprawdzić, czy oligosacharydy są zaangażowane w kierowanie lizosomów, wybraliśmy rezydującą w lizosomach proteazę cysteinową CLCP, która posiada dwa miejsca glikozylacji. Mutacja któregokolwiek z miejsc przekierowała CLCP na szlak sekrecyjny.
  • Podobnie wprowadzenie miejsc glikozylacji do wydzielanej β-amylazy przekierowało to białko do lizosomów. Tak więc, w przeciwieństwie do innych pasożytniczych protists, T. vaginalis wydaje się wykorzystywać glikozylację jako marker rozpoznawania hydrolaz lizosomalnych. Nasze odkrycia dostarczają pierwszego wglądu w złożoność fagolizosomów T. vaginalis, ich biogenezę i rolę w niekonwencjonalnym wydzielaniu peptydaz cysteinowych.
  • Do niepowodzenia wczesnej ciąży dochodzi, gdy dojrzały zarodek przyczepia się do niereceptywnego endometrium. Podczas tworzenia receptywnego endometrium pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) płynów macicznych (UF) dostarczają cząsteczki regulatorowe, takie jak małe RNA, aby pośredniczyć w komunikacji wewnątrzmacicznej między zarodkiem a endometrium. Nie przeprowadzono jednak profilowania małych RNA w EV kozich ultrafiltracji podczas rozpoznawania ciąży (dzień 16). W tym badaniu EV izolowano z UF w 16 dniu cyklu rujowego lub ciąży. Zostały one wyizolowane za pomocą Optiprep  Density Gradient (ODG) i zweryfikowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i Western blot.
  • Immunobarwienie wykazało, że CD63 był obecny zarówno w nabłonku endometrium, jak i nabłonku gruczołowym, a intensywność zabarwienia była większa w endometrium ciężarnej w porównaniu z endometrium nieciężarnym. Sekwencjonowanie małych RNA ujawniło, że EV UF zawierały liczne rodziny sRNA i łącznie 106 miRNA o zróżnicowanej ekspresji (DEM). Dodatkowo uzyskano 1867 genów docelowych DEM i skonstruowano sieci interakcji miRNA-mRNA. Analiza GO i KEGG wykazała, że ​​miRNA były istotnie związane z powstawaniem receptywnego endometrium i implantacją zarodka.
  • Ponadto, test hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH) wykazał, że chi-miR-451-5p ulegał ekspresji głównie w komórkach zrębu endometrium, a wyższy poziom wykryto w nabłonku światła endometrium w stanach ciąży. Co więcej, test z podwójnym reporterem lucyferazy wykazał, że chi-miR-451-5p bezpośrednio wiąże się z PSMB8 i może odgrywać ważną rolę w tworzeniu receptywnego endometrium i implantacji zarodka. Podsumowując, wyniki te pokazują, że EV pojazdów ultrafioletowych zawierają różne małe RNA, które mogą być niezbędne do tworzenia receptywnego endometrium i implantacji zarodka.

Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) zapewniają bezprecedensowe możliwości identyfikacji nowych typów komórek i scharakteryzowania ich stanów.

Jednym z najważniejszych wymagań przy wykonywaniu sekwencji scRNA jest uzyskanie wysokiej jakości pojedynczych komórek w zawiesinie. Ostatnio zastosowaliśmy to podejście do scharakteryzowania   komórek krwi Drosophila (hemocytów). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół uzyskiwania pojedynczych hemocytów w zawiesinie, który można wykorzystać na platformach scRNA-seq opartych na mikroprzepływach. Protokół ten obejmuje proste krwawienie larw w trzecim stadium larwalnym, a następnie oczyszczanie hemolimfy przy użyciu  wirowania w gradiencie opartego na Optiprep lub tradycyjnych metod wirowania w celu uzyskania pojedynczych hemocytów o wysokiej jakości dla sekwencji scRNA.

Co ważne, ta metoda przygotowania pojedynczych hemocytów jest prosta i powtarzalna, z nieistotnymi problemami związanymi z żywotnością komórek, ponieważ cała procedura nie obejmuje dysocjacji enzymatycznej. Streszczenie graficzne: Procedura przygotowania   larwalnych krwinek muszki Drosophila w zawiesinie. Hemocyty (komórki krwi) przedziałów siedzących i krążących larw uzyskuje się przez proste krwawienie i oczyszczanie za pomocą wirowania w gradiencie. Komórki krwi są liczone, a następnie kapsułkowane przez platformy scRNA-seq oparte na mikroprzepływach. Komórki krwi przedstawione na schemacie pochodzą z larw trzeciego stadium larwalnego genotypu  Hemolectin-GAL4.Delta, UAS-2xEGFP  (zapas BDSC nr 30140).

W tym badaniu sprawdziliśmy, czy wokół pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w osoczu krwi tworzy się korona białkowa. Wyizolowaliśmy średniej wielkości powstające EV komórek THP1 oraz  płytek krwi oczyszczonych za pomocą Optiprep i inkubowaliśmy je w osoczu krwi zubożonym w EV od osób zdrowych i pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. EV poddano wirowaniu różnicowemu, chromatografii wykluczania wielkości lub ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, a następnie spektrometrii masowej.

Pojazdy elektryczne pokryte białkiem osocza miały większą gęstość w porównaniu do powstających i zawierały liczne nowo powiązane białka. Interakcje między białkami osocza a EV potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej, testu immunologicznego typu Western, immunomikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej. Zidentyfikowaliśmy dziewięć wspólnych białek koronowych EV (ApoA1, ApoB, ApoC3, ApoE, czynniki 3 i 4B dopełniacza, łańcuch α fibrynogenu, łańcuchy ciężkiej stałej immunoglobuliny γ2 i γ4), które wydają się być powszechnymi białkami koronowymi wśród EV, wirusów i sztucznych nanocząstek w osoczu krwi.

OptiPrep? Density Gradient Medium

M1248-100 Biovision each 301.2 EUR

OptiPrep? Density Gradient Medium

M1248-250 Biovision each 405.6 EUR

OptiClear

NAT1460 Scientific Laboratory Supplies 1USGALLON 236.4 EUR

OptiClear

NAT1462 Scientific Laboratory Supplies EACH 1153.2 EUR

Opticlear R

NAT1466 Scientific Laboratory Supplies EACH 121.2 EUR

Opticlear R

NAT1468 Scientific Laboratory Supplies EACH 549.6 EUR

Opticlear E

NAT1472 Scientific Laboratory Supplies EACH 132 EUR

Opticlear E

NAT1474 Scientific Laboratory Supplies EACH 608.4 EUR

Opticlear S

NAT1478 Scientific Laboratory Supplies EACH 126 EUR

Opticlear S

NAT1480 Scientific Laboratory Supplies EACH 585.6 EUR

Opticlear W

NAT1484 Scientific Laboratory Supplies EACH 190.8 EUR

Opticlear W

NAT1486 Scientific Laboratory Supplies EACH 777.6 EUR

Opticlear S2

NAT1490 Scientific Laboratory Supplies EACH 151.2 EUR

Opticlear S2

NAT1492 Scientific Laboratory Supplies EACH 670.8 EUR

Cow Opticin (OPTC) ELISA Kit

abx516927-96tests Abbexa 96 tests 1093.2 EUR

Dog Opticin (OPTC) ELISA Kit

abx516928-96tests Abbexa 96 tests 1093.2 EUR

Opticin (OPTC) Antibody

abx235998-100ug Abbexa 100 ug 577.2 EUR

Opticin (OPTC) Antibody

20-abx173893 Abbexa
  • 1028.40 EUR
  • 526.80 EUR
  • 1 mg
  • 200 ug

Opticin (OPTC) Antibody

20-abx177862 Abbexa
  • 1446.00 EUR
  • 693.60 EUR
  • 1 mg
  • 200 ug

Opticin (OPTC) Antibody

20-abx217506 Abbexa
  • 510.00 EUR
  • 410.40 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

Human Opticin (OPTC) CLIA Kit

20-abx493844 Abbexa
  • 9567.60 EUR
  • 5095.20 EUR
  • 1177.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Human Optineurin (OPTN)

1-CSB-BP016363HU Cusabio
  • 913.20 EUR
  • 367.20 EUR
  • 2341.20 EUR
  • 1231.20 EUR
  • 1706.40 EUR
  • 517.20 EUR
  • 100ug
  • 10ug
  • 1MG
  • 200ug
  • 500ug
  • 50ug

Opticin (OPTC) Antibody

20-abx114271 Abbexa
  • 878.40 EUR
  • 477.60 EUR
  • 150 ul
  • 50 ul

Opticin (OPTC) Antibody

20-abx008206 Abbexa
  • 360.00 EUR
  • 526.80 EUR
  • 226.80 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 30 ul

Human Optineurin (OPTN)

1-CSB-YP016363HU Cusabio
  • 703.20 EUR
  • 358.80 EUR
  • 2606.40 EUR
  • 1080.00 EUR
  • 1730.40 EUR
  • 458.40 EUR
  • 100ug
  • 10ug
  • 1MG
  • 200ug
  • 500ug
  • 50ug

Human Optineurin (OPTN)

1-CSB-EP016363HU Cusabio
  • 606.00 EUR
  • 318.00 EUR
  • 2192.40 EUR
  • 919.20 EUR
  • 1461.60 EUR
  • 402.00 EUR
  • 100ug
  • 10ug
  • 1MG
  • 200ug
  • 500ug
  • 50ug

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

abx250896-96tests Abbexa 96 tests 895.2 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

abx572792-96tests Abbexa 96 tests 801.6 EUR

Mouse Opticin (OPTC) ELISA Kit

abx516930-96tests Abbexa 96 tests 801.6 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

DLR-OPTC-Hu-48T DL Develop 48T 620.4 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

DLR-OPTC-Hu-96T DL Develop 96T 807.6 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

20-abx152592 Abbexa
  • 8853.60 EUR
  • 4719.60 EUR
  • 1093.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Human OPTC(Opticin) ELISA Kit

EH1604 FN Test 96T 681.12 EUR

Human Opticin, OPTC ELISA KIT

ELI-04700h Lifescience Market 96 Tests 988.8 EUR

Mouse Opticin, Optc ELISA KIT

ELI-04702m Lifescience Market 96 Tests 1038 EUR

Human OPTC/ Opticin ELISA Kit

E1834Hu Sunlong 1 Kit 685.2 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

SEC692Hu-10x96wellstestplate Cloud-Clone 10x96-wells test plate 5677.8 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

SEC692Hu-1x48wellstestplate Cloud-Clone 1x48-wells test plate 572.76 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

SEC692Hu-1x96wellstestplate Cloud-Clone 1x96-wells test plate 766.8 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

SEC692Hu-5x96wellstestplate Cloud-Clone 5x96-wells test plate 3090.6 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

4-SEC692Hu Cloud-Clone
  • 5738.40 EUR
  • 3031.20 EUR
  • 768.00 EUR
  • 10 plates of 96 wells
  • 5 plates of 96 wells
  • 1 plate of 96 wells

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RD-OPTC-Hu-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 625.2 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RD-OPTC-Hu-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 867.6 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RDR-OPTC-Hu-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 652.8 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RDR-OPTC-Hu-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 907.2 EUR

Human Opticin(OPTC)ELISA Kit

QY-E00740 Qayee Biotechnology 96T 433.2 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RDR-OPTC-Hu-48T Reddot Biotech 48T 475.34 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RDR-OPTC-Hu-96T Reddot Biotech 96T 679.04 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RD-OPTC-Hu-48T Reddot Biotech 48T 452.7 EUR

Human Opticin (OPTC) ELISA Kit

RD-OPTC-Hu-96T Reddot Biotech 96T 646.7 EUR

Optimized DMEM

C0003-02 Addexbio RT 500 mL Bottle 120 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

abx391748-96tests Abbexa 96 tests 1093.2 EUR

Human Opticin (OPTC) Protein

20-abx654608 Abbexa
  • 693.60 EUR
  • 309.60 EUR
  • 2064.00 EUR
  • 828.00 EUR
  • 510.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Ra-48T DL Develop 48T 658.8 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Ra-96T DL Develop 96T 861.6 EUR

Bovine Opticin, OPTC ELISA KIT

ELI-04703b Lifescience Market 96 Tests 1113.6 EUR

ELISA kit for Human OPTC (Opticin)

ELK4060 ELK Biotech 1 plate of 96 wells 518.4 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RD-OPTN-Ra-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 668.4 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RD-OPTN-Ra-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 930 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RDR-OPTN-Ra-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 699.6 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RDR-OPTN-Ra-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 973.2 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RDR-OPTN-Ra-48T Reddot Biotech 48T 512.09 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RDR-OPTN-Ra-96T Reddot Biotech 96T 731.54 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RD-OPTN-Ra-48T Reddot Biotech 48T 487.7 EUR

Rat Optineurin (OPTN) ELISA Kit

RD-OPTN-Ra-96T Reddot Biotech 96T 696.7 EUR

ROS Brite™ 700 *Optimized for in Vivo Imaging*

16004 AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Optic Nerve Lysate

XBL-10140 ProSci 0.1 mg 663.9 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

abx235999-100ug Abbexa 100 ug 577.2 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

abx236000-100ug Abbexa 100 ug 661.2 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx177863 Abbexa
  • 1479.60 EUR
  • 710.40 EUR
  • 1 mg
  • 200 ug

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx213783 Abbexa
  • 493.20 EUR
  • 360.00 EUR
  • 100 ul
  • 50 ul

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx213784 Abbexa
  • 493.20 EUR
  • 360.00 EUR
  • 100 ul
  • 50 ul

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx141635 Abbexa
  • 444.00 EUR
  • 727.20 EUR
  • 360.00 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 50 ul

Optineurin (OPTN) Antibody

abx146015-100ug Abbexa 100 ug 469.2 EUR

Human Optineurin (OPTN) CLIA Kit

20-abx493846 Abbexa
  • 9567.60 EUR
  • 5095.20 EUR
  • 1177.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Mouse Optineurin (OPTN) CLIA Kit

20-abx493847 Abbexa
  • 9567.60 EUR
  • 5095.20 EUR
  • 1177.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx114272 Abbexa
  • 878.40 EUR
  • 477.60 EUR
  • 150 ul
  • 50 ul

Optineurin (OPTN) Antibody

abx029929-400ul Abbexa 400 ul 627.6 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

abx029929-80l Abbexa 80 µl 343.2 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx129480 Abbexa
  • 526.80 EUR
  • 159.60 EUR
  • 1479.60 EUR
  • 710.40 EUR
  • 393.60 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Human Opticin (OPTC) Antibody

32101-05111 AssayPro 150 ug 313.2 EUR

Optineurin (OPTN) Antibody

20-abx001525 Abbexa
  • 493.20 EUR
  • 710.40 EUR
  • 218.40 EUR
  • 376.80 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 20 ul
  • 50 ul

ROS Briteâ„¢ 700 *Optimized for in Vivo Imaging*

16004-1mg AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Opticin antibody

70R-50930 Fitzgerald 100 ul 292.8 EUR

Opticin antibody

70R-5283 Fitzgerald 50 ug 560.4 EUR

FBS Opti-Gold, US Origin

F0900-050 GenDepot 500ml 675.6 EUR

Optical EtBr Filter

ELE2522 Scientific Laboratory Supplies EACH 433.2 EUR

Mouse Optineurin (OPTN) ELISA Kit

20-abx154488 Abbexa
  • 8853.60 EUR
  • 4719.60 EUR
  • 1093.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Hu-48T DL Develop 48T 620.4 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Hu-96T DL Develop 96T 807.6 EUR

Mouse Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Mu-48T DL Develop 48T 632.4 EUR

Mouse Optineurin (OPTN) ELISA Kit

DLR-OPTN-Mu-96T DL Develop 96T 825.6 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

20-abx156949 Abbexa
  • 8853.60 EUR
  • 4719.60 EUR
  • 1093.20 EUR
  • 10 × 96 tests
  • 5 × 96 tests
  • 96 tests

Mouse Optineurin, Optn ELISA KIT

ELI-43401m Lifescience Market 96 Tests 1038 EUR

Human Optineurin, OPTN ELISA KIT

ELI-35349h Lifescience Market 96 Tests 988.8 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

SEC702Hu-10x96wellstestplate Cloud-Clone 10x96-wells test plate 5677.8 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

SEC702Hu-1x48wellstestplate Cloud-Clone 1x48-wells test plate 572.76 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

SEC702Hu-1x96wellstestplate Cloud-Clone 1x96-wells test plate 766.8 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

SEC702Hu-5x96wellstestplate Cloud-Clone 5x96-wells test plate 3090.6 EUR

Human Optineurin (OPTN) ELISA Kit

4-SEC702Hu Cloud-Clone
  • 5738.40 EUR
  • 3031.20 EUR
  • 768.00 EUR
  • 10 plates of 96 wells
  • 5 plates of 96 wells
  • 1 plate of 96 wells

Nieoczekiwanym odkryciem tego badania było wysokie nakładanie się składu korony białkowej z agregatami białek osocza krwi. Wyjaśnia to nasze odkrycie, że oprócz rozproszonej, niejednolitej korony białkowej, duże agregaty białkowe również wiążą się z powierzchnią pojazdów elektrycznych. Jednakże, podczas gdy EV z zewnętrznym ładunkiem białek osocza indukowały zwiększoną ekspresję TNF-α, IL-6, CD83, CD86 i HLA-DR ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów, agregaty białkowe wolne od EV nie miały wpływu. Podsumowując, nasze dane mogą rzucić nowe światło na pochodzenie powszechnie zgłaszanego „zanieczyszczenia” preparatów EV białkami osocza i mogą dodać nową perspektywę do badań nad EV.