Lizosom stanowi centralny przedział degradacyjny komórek eukariotycznych, jednak niewiele wiadomo na temat biogenezy i funkcji tych organelli u pasożytniczych protistów. Podczas gdy układ zależny od mannozy-6-fosforanu (M6P) dominuje w celowaniu lizosomalnym u metazoanów, u innych eukariontów donoszono o sortowaniu niezależnym od oligosacharydów. W tym badaniu zbadaliśmy proteom fagolizosomalny ludzkiego pasożyta Trichomonas vaginalis, jego ukierunkowanie na białka i udział lizosomów w wydzielaniu hydrolazy. Organelle oczyszczono za pomocą wirowania gradientowego Percoll i  OptiPrep  oraz nowego protokołu oczyszczania opartego na fagocytozie nanocząstek magnetycznych pokrytych laktoferyną.

Analiza dała proteom lizosomalny składający się z 462 białek, które podzielono na 21 klas. Hydrolazy reprezentowały największą klasę funkcjonalną i obejmowały proteazy, lipazy, fosfatazy i glikozydazy. Identyfikacja dużego zestawu białek zaangażowanych w ruch pęcherzykowy (80) i obrót rearanżacji cytoszkieletu aktynowego (29) wskazuje na dynamiczny przedział fagolizosomalny. Wykazano wcześniej, że kilka proteaz cysteinowych, takich jak TvCP2, jest wydzielanych. Nasze eksperymenty wykazały, że wydzielanie TvCP2 było silnie hamowane przez chlorochinę, która zwiększa wewnątrzlizosomalne pH, wskazując tym samym, że wydzielanie TvCP2 zachodzi raczej przez lizosomy niż przez klasyczny szlak sekrecyjny.

Nieoczekiwanie zidentyfikowaliśmy rozbieżne homologi receptora M6P TvMPR w proteomie fagolizosomalnym, chociaż T. vaginalis nie ma enzymów do tworzenia M6P.

• Aby sprawdzić, czy oligosacharydy są zaangażowane w kierowanie lizosomów, wybraliśmy rezydującą w lizosomach proteazę cysteinową CLCP, która posiada dwa miejsca glikozylacji. Mutacja któregokolwiek z miejsc przekierowała CLCP na szlak sekrecyjny.
• Podobnie wprowadzenie miejsc glikozylacji do wydzielanej β-amylazy przekierowało to białko do lizosomów. Tak więc, w przeciwieństwie do innych pasożytniczych protists, T. vaginalis wydaje się wykorzystywać glikozylację jako marker rozpoznawania hydrolaz lizosomalnych. Nasze odkrycia dostarczają pierwszego wglądu w złożoność fagolizosomów T. vaginalis, ich biogenezę i rolę w niekonwencjonalnym wydzielaniu peptydaz cysteinowych.
• Do niepowodzenia wczesnej ciąży dochodzi, gdy dojrzały zarodek przyczepia się do niereceptywnego endometrium. Podczas tworzenia receptywnego endometrium pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) płynów macicznych (UF) dostarczają cząsteczki regulatorowe, takie jak małe RNA, aby pośredniczyć w komunikacji wewnątrzmacicznej między zarodkiem a endometrium. Nie przeprowadzono jednak profilowania małych RNA w EV kozich ultrafiltracji podczas rozpoznawania ciąży (dzień 16). W tym badaniu EV izolowano z UF w 16 dniu cyklu rujowego lub ciąży. Zostały one wyizolowane za pomocą Optiprep  Density Gradient (ODG) i zweryfikowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i Western blot.
• Immunobarwienie wykazało, że CD63 był obecny zarówno w nabłonku endometrium, jak i nabłonku gruczołowym, a intensywność zabarwienia była większa w endometrium ciężarnej w porównaniu z endometrium nieciężarnym. Sekwencjonowanie małych RNA ujawniło, że EV UF zawierały liczne rodziny sRNA i łącznie 106 miRNA o zróżnicowanej ekspresji (DEM). Dodatkowo uzyskano 1867 genów docelowych DEM i skonstruowano sieci interakcji miRNA-mRNA. Analiza GO i KEGG wykazała, że ​​miRNA były istotnie związane z powstawaniem receptywnego endometrium i implantacją zarodka.
• Ponadto, test hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH) wykazał, że chi-miR-451-5p ulegał ekspresji głównie w komórkach zrębu endometrium, a wyższy poziom wykryto w nabłonku światła endometrium w stanach ciąży. Co więcej, test z podwójnym reporterem lucyferazy wykazał, że chi-miR-451-5p bezpośrednio wiąże się z PSMB8 i może odgrywać ważną rolę w tworzeniu receptywnego endometrium i implantacji zarodka. Podsumowując, wyniki te pokazują, że EV pojazdów ultrafioletowych zawierają różne małe RNA, które mogą być niezbędne do tworzenia receptywnego endometrium i implantacji zarodka.

Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) zapewniają bezprecedensowe możliwości identyfikacji nowych typów komórek i scharakteryzowania ich stanów.

Jednym z najważniejszych wymagań przy wykonywaniu sekwencji scRNA jest uzyskanie wysokiej jakości pojedynczych komórek w zawiesinie. Ostatnio zastosowaliśmy to podejście do scharakteryzowania   komórek krwi Drosophila (hemocytów). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół uzyskiwania pojedynczych hemocytów w zawiesinie, który można wykorzystać na platformach scRNA-seq opartych na mikroprzepływach. Protokół ten obejmuje proste krwawienie larw w trzecim stadium larwalnym, a następnie oczyszczanie hemolimfy przy użyciu  wirowania w gradiencie opartego na Optiprep lub tradycyjnych metod wirowania w celu uzyskania pojedynczych hemocytów o wysokiej jakości dla sekwencji scRNA.

Co ważne, ta metoda przygotowania pojedynczych hemocytów jest prosta i powtarzalna, z nieistotnymi problemami związanymi z żywotnością komórek, ponieważ cała procedura nie obejmuje dysocjacji enzymatycznej. Streszczenie graficzne: Procedura przygotowania   larwalnych krwinek muszki Drosophila w zawiesinie. Hemocyty (komórki krwi) przedziałów siedzących i krążących larw uzyskuje się przez proste krwawienie i oczyszczanie za pomocą wirowania w gradiencie. Komórki krwi są liczone, a następnie kapsułkowane przez platformy scRNA-seq oparte na mikroprzepływach. Komórki krwi przedstawione na schemacie pochodzą z larw trzeciego stadium larwalnego genotypu  Hemolectin-GAL4.Delta, UAS-2xEGFP  (zapas BDSC nr 30140).

W tym badaniu sprawdziliśmy, czy wokół pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w osoczu krwi tworzy się korona białkowa. Wyizolowaliśmy średniej wielkości powstające EV komórek THP1 oraz  płytek krwi oczyszczonych za pomocą Optiprep i inkubowaliśmy je w osoczu krwi zubożonym w EV od osób zdrowych i pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. EV poddano wirowaniu różnicowemu, chromatografii wykluczania wielkości lub ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, a następnie spektrometrii masowej.

Pojazdy elektryczne pokryte białkiem osocza miały większą gęstość w porównaniu do powstających i zawierały liczne nowo powiązane białka. Interakcje między białkami osocza a EV potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej, testu immunologicznego typu Western, immunomikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej. Zidentyfikowaliśmy dziewięć wspólnych białek koronowych EV (ApoA1, ApoB, ApoC3, ApoE, czynniki 3 i 4B dopełniacza, łańcuch α fibrynogenu, łańcuchy ciężkiej stałej immunoglobuliny γ2 i γ4), które wydają się być powszechnymi białkami koronowymi wśród EV, wirusów i sztucznych nanocząstek w osoczu krwi.

Nieoczekiwanym odkryciem tego badania było wysokie nakładanie się składu korony białkowej z agregatami białek osocza krwi. Wyjaśnia to nasze odkrycie, że oprócz rozproszonej, niejednolitej korony białkowej, duże agregaty białkowe również wiążą się z powierzchnią pojazdów elektrycznych. Jednakże, podczas gdy EV z zewnętrznym ładunkiem białek osocza indukowały zwiększoną ekspresję TNF-α, IL-6, CD83, CD86 i HLA-DR ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów, agregaty białkowe wolne od EV nie miały wpływu. Podsumowując, nasze dane mogą rzucić nowe światło na pochodzenie powszechnie zgłaszanego „zanieczyszczenia” preparatów EV białkami osocza i mogą dodać nową perspektywę do badań nad EV.